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无内毒素质粒小量提取试剂盒说明书

产品信息

产品简介

本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过过滤柱除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH  值状态下选择性地结合溶液中的 质粒 DNA ，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 pH  值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA  从硅基质膜上洗脱。

产品内容

产品特色

离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

独有的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM  系列、HB101  也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。

独特内毒素清除方法，清除内毒素效果一般小于<0. 1 EU/μg。

使用方法

（自备试剂：无水乙醇。）第一次使用前请先在漂洗液 WB  瓶中加入指定量无水乙醇，充 分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇， 以免多次加入!将 RNase A  全部加入 溶液 P1  中，混匀，每次使用后置于 2-8℃保存。

1. 向吸附柱 AC  中（吸附柱放入收集管中）加 500μl  的平衡液 BL，12,000rpm  离心 1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取 1.5-4.5  毫升过夜培养的菌液 12,000rpm  离心 30sec ，尽可能的倒干上清，收集菌体。

3.用 250μl  溶液 P1  重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。

4.加 250μl  的溶液 P2 ，温和地上下翻转 4 -7  次（裂解时间不超过 5min）使菌体充分裂解。

5.加 350μl  溶液 P3 ，立即温和地上下翻转 4 -7  次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12,000rpm  离心 5 min。

6.将上清加入到过滤柱 E 中（过滤柱放入 1.5ml 或 2ml 离心管中），12,000rpm 离心 2 min ，收集液体。如上清量较大，请分两次离心。

7.将上述液体转入吸附柱 AC  中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm  离心 30-60sec ，倒掉管中的废液。

可选步骤:  所用菌株为 JM  系列、HB101  等 endA 菌株或野生型菌株时，由于核酸酶含量丰富，应加入 500μl  去蛋白液 PD ，12,000rpm  离心 30-60 sec ，弃废液。

8.加入 500μl  漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm  离心30-60 sec  弃掉废液。

9.重复步骤 8。

10.将吸附柱 AC  放回空收集管中，12,000rpm  离心 2 min ，将吸附柱置于室温放置数 min ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液,  以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11.取出吸附柱 AC ，放入一个干净的离心管中，室温放几分钟。

12. 在吸附膜的中间部位加 50μl- 100μl  洗脱缓冲液 EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置 2 min ，12,000rpm  离心 1 min 。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心 1 min 。(注意： 若用 ddH2O  做洗脱液，应保证其 pH  值在 7.0-8.5  范围内，pH  值低于 7.0  会 降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl ，体积过 小影响回收效率。且DNA  产物应保存在-20℃ , 以防 DNA 降解。)

注意事项

1. 第一次使用时 ，将试剂盒所带的全部 RNase A  加入溶液 P1  后（终浓度 100ug/ml）置于 4℃保存。如果溶液 P1  中 RNase A  失活，提取的质粒可能会有微量 RNA  残留，在溶液 P1  中补加 RNase A  即可。

2.环境温度低时溶液 P2  中 SDS  可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH  值变化。

4.溶液 P3  和去蛋白液 PD  中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾  染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒建议  接种单菌落于 1.5-4.5ml  加合适抗生素的 LB  培养基，过夜培养 14- 16  个小时， 可提取出多达 20µg  的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb  的大  质粒，应适当加大菌体使用量，使用 5- 10ml  过夜培养物，同时按比例增加 P1、P2、P3  的用量，其它步骤相同。

6.得到的质粒 DNA  可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 OD260 值为 1  相当于大约 50μg/ml DNA 。电泳可能为单一条带，也可能为 2  条 或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成， 与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90%。

7.质粒 DNA  确切分子大小，必须酶切线性化后，对比 DNA  分子量 Marker  才 可以知道。处于环状或者超螺旋的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

保存条件

按照产品内容指示温度存放各成份，储存 18  个月不影响使用效果。

1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

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