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质粒大量提取试剂盒说明书

产品信息

产品简介

本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒 DNA ，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA  等杂质， 获得高质量的质粒 DNA 。纯化 DNA  的 OD260/280    通常在 1.8  左右，得到的质 粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对 DNA  纯度要求很高的工作中。 纯化后期过程均在 Eppendorf 管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱， 不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒 DNA  的丢失。本方法提取纯化质粒 DNA，对质粒损伤小，即使是 10kb  甚至 100kb   以 上的大型质粒或超大型 BAC/PAC  质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。

产品内容

产品特色

· 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、从 100- 140 ml  大肠杆菌 LB  培养液中，可快速提取 0.2-0.5mg  纯净的高拷贝质粒DNA ，提取率达 80-90 %。

· 获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

· 内毒素含量极低（<0. 1 EU/μg DNA），可直接应用于细胞转染。

使用方法

（自备试剂：异丙醇、70%乙醇 将 RNase A  全部加入溶液 P1   中，混匀，使用后置于 2-8℃ 保存。）

1.取过夜培养菌<140ml  菌液，装入合适的离心瓶中，4,500~6,000xg  于 4℃离心10 min  沉淀菌体，完全弃除上清。

2.加入 5ml  溶液 P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入 50ml  离心管中，室温放置 3~5 min。

3.加入 5ml  溶液 P2 ，轻轻颠倒离心管 6~8  次，室温放置 5 min ，使细菌完全裂解，溶液透明。

4.加 5ml  溶液 PIII ，立即颠倒离心管 6~8  次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置 5- 10min。

5.上述裂解液于 4℃ 12,000~ 16,000xg  离心 15 min ，小心吸出上清，移入新的 50ml  离心管中。

6.加入 10ml  异丙醇，颠倒离心管，充分混匀(可选：室温放置 10 min)。

7.于 4℃ 12,000~ 16,000xg  离心 10 min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入 3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心 5 min ，弃上清，晾干沉淀。

8.加入 1.4ml  溶液 P1  完全溶解沉淀团块（可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。移入新的 1.5ml  离心管中，60℃水浴放置 10~20 min。

9.最高速离心 2 min ，取上清转入 2  个新的 1.5ml  离心管中（每个 700μl）。每管加入 55μl 杂质清除液 A ，颠倒充分混匀。

10.加入约 0. 1  体积(约 80μl)冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转 7- 10  次（30  秒 左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置≥10 min ，中间偶尔颠倒混匀几次。内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。

11.37℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后 37℃温育 5 min。

12.室温 16,000xg  离心 5- 10 min  分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须至少 20℃以上室温离心）。

13.溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤 10- 11 。上层水相含 DNA ，下层油状相含内毒素和其它杂质。将含 DNA  的上层水相转移到新管（注意不要吸到油状层），弃油状层。

14.可选步骤:  根据对内毒素指标的要求重复抽提 1-2  次，即重复步骤 9- 12  一 两次，该步骤可以提高纯度，但是会损失一定量的质粒 DNA ，请根据具体需要选择使用。

15.将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液 B（约 750μl），轻柔混匀后 冰上放置 10~30 min，4℃ 16,000xg  离心 10 min，弃上清（注意不要丢失 DNA）， 轻轻加入 1ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，室温倒置晾干 5~ 10 min  使乙醇完全挥发。

16.加适量 DNA  溶解液（200~500μl）溶解沉淀（可在 37℃水浴中振荡以辅助 溶解）。要注意很多质粒 DNA  可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒 DNA。

注意事项

1. 第一次使用时 ，将试剂盒所带全部的 RNase A  加入溶液 P1  后（终浓度 100ug/ml）置于 4℃保存。如果溶液 P1  中 RNase A  失活，提取的质粒可能会混杂有微量 RNA 残留，在溶液 P1  中补加 RNase A  即可。

2. 内毒素清除剂在 4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在-20℃。

3.环境温度低时溶液 P2  中 SDS  可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷 贝质粒或大于 10kb   的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2、PIII  的用量。

5.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对DNA 的损坏。

6.DNA 沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心 DNA  丢 失，可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克 DNA 离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。

7.得到的质粒 DNA  可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 OD260 值为 1  相当于大约 50μg/ml DNA 。电泳可能为单一条带，也可能为 2  条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 95%。

保存条件

按照产品内容指示温度存放各成份，储存 18  个月不影响使用效果。

1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

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