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活性氧检测试剂盒(ROS)

Meilun Reactive Oxygen Species Assay Kit

产品信息

产品简介

活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)  包括超氧自由基、过氧化氢、及其下 游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

雪杰特活性氧检测试剂盒(AR Reactive Oxygen Species Assay Kit)  是一种 基于荧光染料 DCFH-DA (2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)  的荧光强度 变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。

DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细 胞内的酯酶水解生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标 记到细胞内。在活性氧存在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF ，绿色 荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性 氧的水平。在激发波长 502 nm ，发射波长 530 nm 附近，使用荧光显微镜、激光 共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测 DCF 荧光， 从而测定细胞内活性氧水平。

本试剂盒背景低、灵敏度高、线性范围宽、使用方便，可以用于各种真核培 养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂 Rosup ，以便于活性氧的检 测。 以 96 孔板每孔加样量为标准，ZD28110-100T可测定约 100 次，ZD28110-500T 可测 定约 500 次。

产品内容

操作步骤

1  装载探针

对于刺激时间较短 (通常为 2  小时以内) 的细胞，先装载探针，后用活性氧阳 性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长 (通常为 6  小时 以上) 的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

1.1  原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞)

① 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到 50~70%。 【注】：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。

② 探针准备：探针装载前按照 1:1000  用无血清培养液稀释 DCFH-DA ，使其 终浓度为 10μM。

③ 探针装载：吸除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA  工作液。加 入的体积以能充分盖住细胞为宜，如，对于 6  孔板通常不少于 1000 μL，对于 96 孔板通常不少于 100μL 。37℃细胞培养箱内避光孵育 20~30 min。

④ 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞 3  次， 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

⑤ 药物诱导：加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物， 于 37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性， 以及细胞类 型来决定。

(可选)阳性对照：先用无血清培养基等 1:1000  稀释阳性对照(Rosup, 50mg/ml)， 加入细胞，一般 37℃避光孵育 20~30 min  可显著看到活性氧水平提高，但依细 胞类型会有比较明显差异。(如，HeLa  细胞孵育 30 min ；MRC5  人胚胎成纤维 细胞 1.5 h)

1.2  收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

① 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。按照适 当方法，清洗并收集足量的细胞。

② 探针准备：探针装载前，按照 1:1000  用无血清培养液稀释 DCFH-DA ，使 其终浓度为 10 μM。

③ 探针装载：细胞收集后悬浮于加入适当体积稀释好的 DCFH-DA  工作液，使 其细胞密度为 1.0×106~2.0×107/mL，37℃细胞培养箱内避光孵育 20~30 min，每隔 3-5 min  颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

【注】：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法， 以及检测总量来进行调整。如，对于

流式分析，单管检测内细胞数目不少于 104 ，也不可多于 106。

④ 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞 3  次， 以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。

⑤ 药物诱导：将细胞悬浮于适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓 度的药物中，或把细胞等分成若干份后再进行药物刺激，于 37℃细胞培养箱内 避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。

(可选)阳性对照：先用无血清培养基等 1:1000  稀释阳性对照(Rosup, 50mg/ml)， 加入细胞，一般 37℃避光孵育 20~30 min  可显著看到活性氧水平提高，但依细 胞类型会有比较明显差异。(如，HeLa  细胞孵育 30 min ；MRC5  人胚胎成纤维 细胞 1.5 h)

2  检测

原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、 荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可 以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3  参数设置

使用 488 nm  激发波长，525 nm  发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光 的强弱。

DCF  的荧光光谱和 FITC  非常相似，可以用 FITC  的参数设置检测 DCF。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图。

其他事项说明：

1.  阳性对照 Rosup 通常按照 1:1000 的比例使用。通常刺激后 20~30 min 可以观 察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较 大的差别。如果在刺激后 30 min 内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或 适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适 当降低活性氧阳性对照的浓度。

2.  对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1:2000~1:5000 稀释 DCFH-DA ，使装载探针时 DCFH-DA  的浓度为 2~5 μM。 探针装载的时间也可以根据情况在 15~60 min 内适当进行调整。

3.  活性氧阳性对照 (Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品 中都需加入活性氧阳性对照。

注意事项：

1.  探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2.  探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫 描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF  的激发光谱和发射光谱请参考上页 图谱。

3.  尽量缩短探针装载后到测定所用的时间 (刺激时间除外)，以减少各种可能的 误差。

保存条件

-20ºC 避光保存，一年有效。

1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。

2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。

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