本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断

呕吐毒素（DON）ELISA检测试剂盒

使用说明书

一、检测原理

本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被呕吐毒素抗原，加入样本/呕吐毒素标准品溶液及呕吐毒素抗体。样本或标准品溶液中的呕吐毒素与预包被在板孔上的呕吐毒素抗原竞争结合呕吐毒素抗体，未结合的抗体在洗涤时被除去，酶标二抗可与抗体反应，再通过酶的专一性显色剂显色，因为酶可以使无色的显色剂转变成蓝色，终止液的加入可以终止显色，蓝色转变成黄色，吸收值可以在450nm处进行测定。样本的吸光值与其所含残留物呕吐毒素抗原的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物呕吐毒素的含量。

二、检测范围

本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出大米、玉米等谷物及饲料中的呕吐毒素。

三、试剂盒组成

酶标板1块，96孔/板

标准液5瓶（1 mL/瓶）：0 ppb, 5 ppb, 15 ppb, 45 ppb, 135 ppb

抗体工作液                7mL

酶标记物                  7mL

显色液                   15mL

终止液                    8mL

10×浓缩洗涤液           40mL

1×样本稀释液            50mL

2M NaOH(调样本pH用)       2mL

说明书                    1份

四、使用单位需自备的设备及试剂

（1）仪器

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)

振荡器

离心机

粉碎机

电子天平（感量0.01 g）

（2）器材

单道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）试剂

去离子水

五、溶液的配制

样本前处理需配制：

配液1: 洗涤工作液

用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1 : 9体积比进行稀释，即1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水。

六、样本前处理方法

样本处理前须知：

   处理任何样本时，都须注意：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤：

（A）饲料、谷物（稀释倍数：40）

1、取1g粉碎好的样品，加入20ml水，混匀；

2、充分振荡3min；

3、4000rpm室温离心5min，或用定量分析滤纸过滤；

4、取0.5 mL离心后的上清液或过滤后的滤液加入到0.5mL样本稀释液中进行稀释并充分混匀；

5、调整稀释后的液体的PH值，使PH值在6~8之间；

6、取50μL稀释后的液体待测。

注：所测样本客户可根据自身的情况等比例放大稀释倍数来保持稀释倍数不变，如样本处理（A）1g样本加20ml水变为5g样本加100ml水，其他不变。

（B）大麦、小麦、面粉、次粉、麸皮（稀释倍数：40）

1、取1g粉碎好的样品，加入5ml去离子水，混匀；

2、充分振荡3min；

3、4000rpm室温离心5min，或用定量分析滤纸过滤；

7、取100μL离心后的上清液或过滤后的滤液加入到700μL去离子水中进行稀释并充分混匀；

8、调整稀释后的液体的PH值，使PH值在6~8之间；

9、取50μL稀释后的液体待测。

注：所测样本客户可根据自身的情况等比例放大稀释倍数来保持稀释倍数不变，如样本处理（A）1g样本加5ml水变为5g样本加25ml水，其他不变。

七、酶联免疫检测步骤

测定前须知：

1、 使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

3、 在使用中不要让微孔干燥。

4、 在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

5、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

测定步骤：

1、将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷冻。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本50ml到对应的微孔中，加入酶标记物50ml/孔，再加入抗体工作液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温（25℃）避光反应15min。

6、 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，250ml/孔，洗板3次，每次间隔15s，用吸水纸拍干。

7、 加入显色液100mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温（25℃）避光反应5 min。

8、 加终止液50mL/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。

八、结果分析

所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以第一个标准液（0标准液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值。

以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含呕吐毒素的量。

利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

九、试剂盒灵敏度、准确度、精密度

    试剂盒灵敏度：5ppb

          样本最低检测限：

大麦、小麦、面粉、次粉、麸皮            200ppb

谷物、饲料                         200ppb

回收率：    

大麦、小麦、面粉、次粉、麸皮          80±15%

饲料、谷物                              80±15%

精密度：

试剂盒的变异系数均小于10%

十、注意事项

1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤；若不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。

4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

5、保存试剂盒于2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之；0标准的吸光度（450 nm）值小于0.5（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

7、在加入底物液后，一般显色5 min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到10 min（或更长），但不得超过30 min；反之，则减短反应时间。

8、该试剂盒最佳反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十一、贮藏条件及保存期

贮藏条件：在2~8 ℃保存试剂盒。

保存期：本试剂盒有效期为12个月。

FOR RESEARCH USE ONLY; NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS! PLEASE READ THROUGH ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!

本说明书由专业ELISA试剂盒生产商雪杰特为您提供。