一、产品简介：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、 植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对 电子从 NADH 传递给 CoQ ，同时可使 O2 还原生成 O2.-，是呼吸电子传递链上产生 O2.- 的主 要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性 氧（ROS）生成状态。
复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成 NAD+ ，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率进而得 出该酶活性大小。
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线粒体复合体 I 试剂盒使用说明书
分光法 48 样
一、产品简介：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、 植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对 电子从 NADH 传递给 CoQ ，同时可使 O2 还原生成 O2.-，是呼吸电子传递链上产生 O2.- 的主 要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性 氧（ROS）生成状态。
复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成 NAD+ ，在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率进而得 出该酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体 60mL× 1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体 15mL× 1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体 0.5mL× 1 支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体 2mL× 1 支 | 4℃保存 | |
试剂五 |
粉剂×2 支 |
4℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部， 分别加 1. 1mL 蒸馏水溶解备用。用不 完的试剂分装后-20℃保存，禁止反 复冻融，三天内用完。 |
试剂六 | 液体 35mL× 1 瓶 | 4℃保存 |
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、低温台式离心机、 研钵、冰和蒸馏水。
四、线粒体复合体 I 活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！
1 、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）：
① 称取约 0. 1g 组织或收集 500 万细菌/细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀 浆，转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min。
② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃× 12000g 离心 10min。沉淀即为提取的线粒体， 用作第④步操作。
③ (选做) 上步得到的上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒 体呼吸链复合体 I ，用于判断线粒体提取效果。
④ 在沉淀（线粒体）中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W ，超声3s ，间隔10秒，重复30次），液体置于冰上用于线粒体复合体I酶活性测定。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例进行提取，或按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~ 1000：1 的比例进行提取。
2 、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，设定温度 25℃ , 调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。
② 若待测上清液比较浑浊（蛋白浓度比较高），可先对样本进行梯度稀释或按照下方加样 表梯度减少样本加样量（试剂六相应增加）进行预测定实验。
③ 将试剂四和五和六置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）于恒温振荡培养箱 或水浴锅中孵育 15min；在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入：
试剂名称(μL） | 测定管 |
试剂四 | 40 |
试剂五 | 40 |
试剂六 | 680 |
样本 | 40 |
混匀，立即于 340nm 处读取 A1 ，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）， 10min 后读取 A2 ，△A=A1-A2。 | |
【注】
1. 若△A 的值在零附近徘徊，可以增加样本加样体积（如增至 60μL ，试剂六相应减少），则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来 参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
3. 若ΔA 的值大于 0.25 ，则需减少反应时间 T（如减至 5min），则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1 、按样本蛋白浓度计算：酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。复合体 I 活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2× 109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.5 ×ΔA÷Cpr
2 、按样本鲜重计算：酶活定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。复合体 I 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2× 109]÷(W×V1÷V)÷T=65×ΔA÷W
3 、按细菌/细胞密度计算：酶活定义：每 1 万个细菌/细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 复合体 I 活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2× 109]÷(500×V1÷V)÷T=0.13×ΔA
ε---NADH 摩尔消光系数，6.22× 103 L/mol/cm； d---光径，1cm；
V---加入提取液体积，0.202 mL； V1---加入样本体积，0.04mL；
V2---反应体系总体积，8 × 10-4 L； T---反应时间，10min；
W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万；
Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
有效期：3 个月
免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
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