Beijing CHEJETER Technology Co.,Ltd.
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Chejeter DNA/RNA 转染试剂说明书
产品信息
| 产品名称 | 产品货号 | 规格 | |||
| Chejeter DNA/RNA 转染试剂 | ZY21410 | 0.5mL | |||
| ZY21410 | 1mL | ||||
| ZY21410 | 1.5mL | ||||
产品简介
Chejeter 转染试剂由可生物降解的聚阳离子与其它成分按特定比例配制而成，适用于 DNA 、RNA 的 转染 。Chejeter 转染试剂与传统的脂质体转染剂相比无论在稳定性、转染效果和实验操作上都有明显的优势。Chejeter 转染试剂对绝大多数贴壁细胞有较高的转染效率，重复性好，操作简单。转染试剂和外源 DNA、 RNA 可以形成纳米复合物。形成的纳米复合物可以直接加入完全细胞培养液中，不需要通过更换培养液来 去掉转染试剂和 DNA/RNA 纳米复合物来降低转染剂的细胞毒性。通过对照实验发现，本制品的转染效果 不受培养液中血清和抗生素的影响，可以通过简单地调整转染试剂和外源 DNA 、RNA 的比例来获得最佳的 转染效率。
产品特色
具有极高的转染效率；
细胞毒性小 ，且转染稳定；
操作简单；
操作步骤
无血清培养基、0. 15M NaCl (双蒸水配制，高压或过滤灭菌) 均可作为转染剂和 DNA/RNA 的稀释剂。
DNA染色方法
使用方法（以 24 孔细胞板转染实验为例）
1 . 转染细胞的准备
2 . 贴壁细胞：转染前一天（24小时） 24 孔板中，每孔接种 1~2×105 个细胞， 1ml 完全培养基，使之 转染时能够达到 70-90%汇合度。
注：贴壁细胞也可以在传代后直接按悬浮细胞方法进行转染。也可以在传代后细胞贴壁基本完成时(如 HeLa 细胞传代后通常在 2 小时内就完全贴壁) 开始转染。但这些简便方法实施的前提是传代时的细胞状态要非 常好 ，不能用过度培养的细胞。此外，接种细胞的培养液在进行转染时已经 24 小时了，如果已经发黄， 最好在转染时更换为新鲜培养基。离心收集悬浮细胞，用新鲜的培养基重悬细胞并按每孔 1~2×105 个细胞， 1ml 完全培养基接种 到 24 孔板中。
3 . 对大部分细胞而言，质粒 DNA (μg) 和转染剂 Chejeter (μl) 的比例大致为 1:3- 1:5 。在两个无菌的离心 管里分别加入 50μl 无血清培养基，其中一个管中加入质粒 DNA ，轻柔混匀，制成 DNA 稀释液。另一个 离心管里加入 Chejeter 轻柔混匀，制成 Chejeter 稀释液。
注： DNA 和转染试剂的最适用量需要根据不同细胞和不同培养基来优化。对 24 孔板而言，每孔中两者 的用量一般不超出 1~2μg 和 3~5μl 范围。相同转染效率条件下，尽可能降低转染剂用量。
4 . 将 50μl Chejeter 稀释液滴加到 50 μ l DNA 稀释液中，用吸头轻轻吹打混匀。室温放置 5 分钟，从而 获得 100 μ l 转染复合物。
5. 将制备好的转染复合物直接加入到细胞培养基中，轻摇细胞板以混匀。转染复合物可直接加入含血清 的细胞培养基中。
6. 将细胞板移至 37℃ ，5% CO2 孵箱中进行培养，24-72 小时后可进行下游实验。
7. 如果要筛选稳定细胞株，转染 24 小时后将细胞按照 1:10 或更高的比例稀释，传代到其它的培养板中， 次日添加合适浓度的药物 (如 G418 , Zeocin 等) 进行筛选。
转染过程的优化：
不同细胞培养器皿的表面积比较
培养皿 | 96 well | 48 well | 24 well | 12 well | 6 well | 35mm | 60mm | 100mm |
面积 (cm2 ) | 0.3 | 0.7 | 2 | 4 | 10 | 10 | 20 | 60 |
与 24 well 面积比值 | 0.2 | 0.4 | 1 | 2 | 5 | 5 | 10 | 30 |
RNA转染方法
1.转染时细胞能够达到 60-80%汇合度。
2.使用无血清培养基如：Opti-MEM 稀释 Chejeter 转染试剂.
3.使用无血清培养基如：Opti-MEM 稀释 siRNA。
4.将稀释的 Chejeter 转染试剂加入到稀释的 siRNA 中(1:1 比例)。
5.室温孵育 5min。
6.将 siRNA 转染复合物加入到细胞中，37℃培养 1-3 天。
7.分析转染细胞。
转染试剂转染 siRNA 体系推荐：
制备的混合物足以进行三孔(96 孔细胞板) 、两孔(24 孔细胞板)和单孔(6 孔细胞板)转染，并考虑移液变化。
组分 | 96-well | 24-well | 6-well |
Cells | 1–4 × 104 | 0 .5–2 × 105 | 0.25– 1 × 106 |
Opti-MEM | 25 μL | 50 μL | 150 μL |
Chejeter | 1.5 μL | 3 μL | 9 μL |
Opti-MEM | 25 μL | 50 μL | 150 μL |
siRNA( 10 μM) | 0 .5 μL (5 pmol) | 1 μL ( 10 pmol) | 3 μL (30 pmol) |
共稀释 siRNA 体积 | 25 μL | 50 μL | 150 μL |
共稀释 Chejeter 体积 | 25 μL | 50 μL | 150 μL |
混合后室温孵育 5 分钟。 | |||
组分 | 96-well | 24-well | 6-well |
siRNA 转染复合物/每孔 | 10 μL | 50 μL | 250 μL |
siRNA 使用量/每孔 | 1 pmol | 5 pmol | 25 pmol |
Chejeter 使用量/每孔 | 0 .3 μL | 1.5 μL | 7 .5 μL |
将 siRNA 转染复合物加入到细胞中，37℃培养 1-3 天。然后，分析转染细胞。 | |||
注意事项
1. 质量DNA与 siRNA的共转染
每 1 μg DNA 加入 30 pmol (~0.6 μg) siRNA ，同时转染质粒 DNA 和 siRNA。
2. miRNA 转染方法可参考 siRNA 转染方法。
3. mRNA 或 shRNA 转染：使用 Chejeter 将 mRNA 或长链 shRNA 转染到 24 孔板中，每孔加入 0.5- 1 μg 的mRNA 或长链 shRNA。
4.问题解决方法
问题 | 解决方法 |
转染效率低 | 1 .质粒浓度太低- 建议：使用最适量的质粒。 |
2 . 质粒纯度太低-建议：使用高质量的质粒(OD260/OD280≥ 1.8)。 | |
3 . 细胞生长状态欠佳- 建议： 保证细胞密度和形态是最佳的。 | |
4 . 减半转染时培养液体积 (转染 4 小时后再补加足量培养液) 。 | |
5. 设立阳性对照，例如混入转染质粒总量 1/ 10 量的表达 EGFP 的质粒。 | |
细胞毒性太大 | 1 . 接种前，细胞的生长状况直接影响细胞活性。 |
2 . 转染时细胞密度不能过低。 | |
3 . 增加转染时培养液体积，或保持 Chejeter/DNA 或 RNA 比率的同时减少 Chejeter 的用量。 | |
4 . 对于敏感细胞株，转染 4 小时后去除含转染复合物的培养液，更换新鲜的完全培养液。 | |
5 . 确定基因产物是否有毒性。 |
运输： 常温
储存：2- 8 ℃保存一年；-20℃保存二年以上。
1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
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